Bolile genetice sunt încă o provocare globală, deoarece sunt cauzate de mutații ale genelor care afectează funcțiile biologice, procesele metabolice sau producția anumitor proteine esențiale ale indivizilor, la diferite tulburări moștenite. Medicamentele de terapie genetică sunt un tip de intervenție terapeutică care vizează anumite gene, având ca scop repararea sau modificarea acestora și oferind noi instrucțiuni pentru ca celulele să producă proteine funcționale sau să intervină în defectele genelor care cauzează boli.
Medicamentele genice comune includ în principal ADN și ARN, unde ADN-ul poate fi fragmente de gene sau secvențe de gene cu efecte terapeutice. Acest ADN este livrat celulelor pentru a înlocui sau completa funcțiile genetice defecte sau lipsă. ARN poate fi ARN mesager (ARNm), ARN mic de interferență (siARN) sau oligonucleotide antisens (ASO), etc., care pot fi utilizate pentru a modifica, inhiba expresia genelor dăunătoare sau restabili funcția unor gene specifice.
Cu toate acestea, atât ADN-ul, cât și ARN-ul se confruntă cu multe provocări de la intrarea în corpul uman până la atingerea celulelor țintă. Deoarece secvențele de gene sunt instabile în tractul gastrointestinal, ele sunt de obicei administrate prin injecție intravenoasă sau subcutanată, dar chiar și așa, majoritatea secvențelor de gene sunt încă degradate de nucleazele abundente din corpul uman.
Când o cantitate mică de medicamente reziduale de gene ajunge în exteriorul celulelor țintă, acestea nu pot intra în celule deoarece secvențele genelor sunt molecule mari cu grupuri de fosfat purtând sarcini negative, în timp ce membranele celulare poartă și sarcini negative. Când două sarcini negative se întâlnesc, genele sunt respinse și nu pot intra în celule. Prin urmare, trebuie să dezvoltăm metode specifice de livrare a medicamentelor genice pentru a preveni degradarea lor in vivo și pentru a îmbunătăți eficiența penetrării membranei celulare și pentru a furniza secvențe de ADN sau ARN celulelor fără probleme.
Metode de livrare pentru medicamentele genice
Metodele curente comune de livrare a genelor sunt împărțite în principal în două categorii: livrarea vectorului viral și livrarea vectorului ne-viral. Livrarea vectorului viral include în principal virusul adeno-asociat (AAV) și lentivirusul etc., care pot simula procesul de infectare cu virus a celulelor gazdă și pot traversa cu ușurință barierele celulare, obținând astfel o eficiență ridicată de livrare. Cu toate acestea, livrarea vectorului viral are și probleme: în primul rând, are o capacitate de ambalare limitată, cum ar fi capacitatea maximă de ambalare a AAV este de 4,7 kb, care nu poate furniza secvențe de gene mai lungi; în al doilea rând, vectorii virali pot provoca reacții imune grave, inclusiv imunitatea celulară și imunitatea umorală, prezentând riscuri pentru aplicațiile clinice. În comparație cu aceasta, vectorii non-virali au avantaje uriașe în ceea ce privește siguranța și capacitatea de încărcare a medicamentelor.
Vectorii ne-virali utilizați în mod curent includ în principal lipozomi, polimeri, nanoparticule, exozomi etc., printre care lipozomii sunt vezicule formate din molecule amfifile cu diametre cuprinse între 100 nm și 1um. Sunt compuse în principal din fosfolipide, colesterol, lipide PEG și lipide cationice. Structura cu două straturi fosfolipide este similară cu membranele celulare și poate pătrunde fără probleme în celule prin endocitoză. În plus, lipozomii pot modifica, de asemenea, PEG sau anticorpii specifici de pe suprafața lor pentru a scăpa de clearance-ul imunitar al organismului, în timp ce țintesc anumite țesuturi sau celule. Lipozomii cationici sunt lipozomi care conțin lipide de sare de amoniu cuaternară încărcate pozitiv, care se pot lega mai bine cu medicamentele cu acid nucleic încărcate negativ și pot menține stabilitatea sistemului de livrare. Prin urmare, lipozomii sunt una dintre metodele obișnuite de eliberare a vectorilor ne-virali pentru medicamentele genetice.
Cu toate acestea, lipozomii tradiționali au și unele probleme: în primul rând, datorită dimensiunii mari a diametrelor lipozomilor, deși acest lucru poate asigura o capacitate suficientă de încărcare a medicamentului, atunci când lipozomii trec prin golul endotelial vascular (100-200nm), dimensiunea prea mare va împiedica acest proces. În plus, după ce lipozomii pătrund în celule prin endocitoză și formează sistemul endozom-lizozom, lipozomii tradiționali nu pot completa scăparea lizozomală în timp, ceea ce duce la degradarea majorității medicamentelor genetice de către lizozomi și incapabile să își exercite efectele. Pe baza acestor deficiențe ale lipozomilor tradiționali în administrarea medicamentelor genetice, nanoparticulele lipidice (LNP) au fost dezvoltate și au devenit o metodă de livrare importantă, potrivită în special pentru livrarea acizilor nucleici către celulele și țesuturile țintă.
Introducere în sistemul LNP Carrier
Nanoparticulele lipidice (LNP) sunt nanoparticule compuse din substanțe asemănătoare lipidelor și un diametru, în general, cuprins între 10-200 nm. În comparație cu lipozomii tradiționali, aceștia sunt mai mici și mai ușor de trecut prin golurile endoteliale vasculare. În plus, LNP consta de obicei din lipide cationice/ionizabile, fosfolipide auxiliare, lipide polietilenglicol (PEG) și colesterol. Printre acestea, fosfolipidele auxiliare și colesterolul pot crește stabilitatea LNP; Lipidele PEG ajută la creșterea timpului de circulație al LNP in vivo și la reducerea reacțiilor imune. Aceste componente au funcții similare cu lipozomii tradiționali. Diferența constă în lipidele cationice/ionizabile, care sunt, de asemenea, principalul domeniu de protecție prin brevet pentru LNP.
După cum sa menționat mai devreme, lipozomii cationici pot menține în mod eficient legarea cu medicamentele cu acid nucleic și pot îmbunătăți eficiența de livrare a medicamentelor cu acid nucleic. Cu toate acestea, lipozomii cationici sunt, de asemenea, predispuși la legarea ne-specifică cu proteinele plasmatice încărcate negativ, celulele sanguine etc. în circulația corpului, provocând agregarea lipozomilor și fiind eliminate rapid din organism (timp-durata de înjumătățire a lipozomilor cationici in vivo este de numai 15 minute).
Pentru a rezolva această problemă, cercetătorii au dezvoltat un nou tip de material lipidic numit lipide ionizabile. Lipidele ionizabile sunt foarte asemănătoare ca structură cu lipidele cationice. Luând ca exemple lipidele cationice comune DOTAP și lipidele ionizabile DODAP, diferența este că DOTAP este o sare de amoniu cuaternară cu o sarcină pozitivă, în timp ce DODAP este o structură de amină terțiară. Structura aminei terțiare poate menține pKa-ul lipidei între 6-7. Când pH-ul este mai mic decât pKa (în condiții acide), lipidele ionizabile sunt încărcate pozitiv.
Când pH-ul este aproape de pKa (în condiții neutre), lipidele ionizabile sunt neutre. Acest design poate rezolva în mod inteligent problema întâlnită de lipozomii cationici: deoarece pH-ul din circulația sângelui este aproape de neutru, lipidele ionizabile sunt, de asemenea, neutre, iar legarea ne-specifică dintre ele și proteinele plasmatice sau celulele sanguine este redusă semnificativ, prelungind timpul-de înjumătățire. În plus, atunci când lipidele ionizabile LNP sunt preluate de celule și intră în lizozomi, lipidele sunt ionizate și încărcate pozitiv în mediul lizozomal cu pH 5-6. Lipidele încărcate pozitiv sunt ușor fuzionate cu membrana endozom-lizozom, permițând lipozomilor să scape în citoplasmă, să se disocieze și să elibereze acizi nucleici, exercitându-și astfel efectele. În rezumat, proiectarea sistemului purtător LNP implică optimizarea compoziției lipidelor, a dimensiunii particulelor, a încărcăturii de suprafață și a stabilității pentru a obține o livrare eficientă a genelor.
Strategia de bioanaliza LCMS pentru medicamentele genetice ambalate LNP-
Medicamentele genetice ambalate LNP-constă în principal din învelișul LNP și medicamentul genic în sine. Învelișul LNP este alcătuit în principal din componente lipidice (lipidele cationice/ionizabile reprezintă aproximativ 30-50%, lipidele PEG reprezintă aproximativ 2%, colesterolul reprezintă aproximativ 20-50%, fosfolipidele auxiliare reprezintă aproximativ 10-20%), în timp ce medicamentele genice constau în principal din secvențe de gene și fragmente ADN, ASO, etc. Conform celor mai recente reglementări ale NMPA și FDA[14-15], pentru aplicarea IND a medicamentelor din sistemul de eliberare a medicamentelor, cum ar fi LNP, pe lângă efectuarea de studii farmacologice și farmacocinetice asupra ingredientului activ (secvența genelor), sunt necesare, de asemenea, evaluarea siguranței și farmaceutice pentru noile componente lipidice care nu au fost utilizate în sistemele de eliberare a medicamentelor pe piață, cum ar fi medicamentele lipidice și PEG. lipide cu modificări speciale în LNP.
Bioanaliza LCMS a lipidelor LNP se concentrează pe lipidele cationice/ionizabile și pe lipidele PEG. Datorită diferențelor structurale dintre ele, greutatea moleculară a lipidelor cationice/ionizabile este în general de 1 kDa, în timp ce greutatea moleculară a lipidelor PEG poate ajunge la 2~5 kDa după purtarea grupelor de modificare, rezultând diferențe mari în retenția cromatografică și răspunsul la spectrometria de masă între ele. Având în vedere că conținutul de lipide cationice/ionizabile din LNP este mai mare decât cel al lipidei PEG, diferența de răspuns duce la incapacitatea de a unifica eficient metodele de pretratare (selectarea solventului de extracție, determinarea factorului de diluție) ale ambelor. În plus, datorită prezenței multor vârfuri de interferență în jurul poziției de vârf a lipidei PEG, este adesea necesar un gradient mai lung de separare a fazei lichide pentru o separare eficientă, care nu poate garanta o eficiență ridicată a analizei. Prin urmare, stabilim separat metoda de detectare a lipidelor PEG în bioanaliza. În același timp, lipidele cationice/ionizabile și lipidele PEG au, de asemenea, dificultăți comune în dezvoltarea metodei din cauza componentelor lor lipide, cum ar fi solubilitatea slabă în apă, instabilitatea în matricea biologică, legarea proteinelor la recuperarea depășind limita, interferența ridicată și reziduul lipidelor PEG, schimbarea stabilității lipidelor în matricea eșantionului real și dificultatea în selecția standardului intern.
